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它的作用机制主要是松弛血管的平滑肌，达到扩张血管的目的。硝酸甘油属于硝酸酯类药物，是防治冠心病、心绞痛的特效常用药之一。
硝酸甘油在平滑肌细胞与硝酸酯受体结合，并且被硝酸酯受体的巯基还原成氧化氮或者是亚硝巯基，释放的氧化氮舒张血管，从而达到降低血压的作用。并且硝酸甘油还能降低心肌的耗氧量，能够使容量血管扩张而降低前负荷，心室舒张末容量及压力均能降低，从而起到缓解心绞痛的作用。
此外，硝酸甘油在较大剂量下也能扩张小动脉而降低后负荷，从而使室壁肌张力及耗氧减低。并且还能够扩张冠状动脉，能明显地舒张较大的心外膜血管及狭窄的冠状血管以及侧支血管，此外作用在冠状动脉痉挛时更为明显，它对阻力血管的舒张作用微弱。当冠状动脉因粥样硬化或痉挛而发生狭窄时，缺血区的阻力血管因缺氧而处于舒张状态。而非缺血区阻力就较缺血区大，用药后迫使血液从输送血液经侧枝血管流向缺血区，而改善缺血区的血液供应。
硝酸甘油还能增加心内膜的供血，改善心肌顺应性，降低左心室舒张末压，舒张心外膜血管及侧支血管，使血液更容易从心外膜区域向心内膜下缺血区流动，从而改善心肌缺血区的血流量，达到保护心肌缺血心肌细胞的作用。